Resistencia concomitante antitumoral: un posible mecanismo de control de las metástasis / 1 CONCOMITANT TUMOR RESISTANCE: A POSIBLE CONTROL MECHANISM OF THE GROWTH OF METASTASES

La Resistencia Concomitante Antitumoral (RC) es el fenómeno según el cual un individuo portador de un tumor inhibe o retarda el crecimiento de implantes tumorales secundarios. Este fenómeno ha sido descripto en animales y en seres humanos y puede ser inducido tanto por tumores inmunogénicos como no-inmunogénicos. El estudio de la RC puede darnos indicios sobre mecanismos de control de las metástasis desde que las metástasis son, de hecho, implantes secundarios naturales desarrollados espontáneamente durante el crecimiento de un tumor primario. En este sentido la experiencia clínica y numerosos datos experimentales han revelado que la extirpación quirúrgica de un tumor puede ser seguida por una abrupta aceleración del crecimiento metastásico sugiriendo que, bajo ciertas circunstancias, un tumor puede ejercer un control inhibitorio sobre sus propias metástasis. En nuestro laboratorio hemos estudiado la RC asociada al crecimiento de numerosos tumores de ratón de diferente origen, tipo histológico e inmunogenicidad. Nuestros resultados demostraron que durante el crecimiento de un tumor primario se generan dos eventos temporalmente separados de RC. El primer evento es producido sólo por tumores inmunogénicos de pequeño tamaño (<500 mm3 ), es específico de tumor y es producido por mecanismos inmunológicos dependientes del timo. Por otro lado, el segundo evento de RC es inducido tanto por tumores inmunogénicos como no-inmunogénicos de gran tamaño (≥ 2000 mm3 ), no es específico de tumor, es timo independiente y correlaciona con la presencia de un factor sérico de bajo peso molecular que demostró tener capacidad para inhibir la proliferación de células tumorales tanto in vitro como in vivo. Cuando esta actividad antitumoral no estaba presente en el suero ­en nuestros modelos, los dos únicos casos estuvieron asociados a tumores altamente metastásicos­ el segundo evento de RC no se producía. Estos resultados sugieren una correlación directa entre la actividad sérica antitumoral, el segundo evento de RC y la capacidad para restringir el crecimiento metastásico.Aunque el primer evento de RC es producido, como dijimos arriba, por una respuesta inmunológica convencional mediada por células T, la naturaleza química del factor sérico asociado a la más universal manifestación de la RC (esto es, el segundo evento de RC), permaneció siendo un enigma por muchos años. En un trabajo reciente, identificamos ese factor sérico antitumoral como una mezcla de metatirosina y orto-tirosina, dos isómeros de tirosina que no están presentes en proteínas normales. Ambos isómeros fueron capaces de inhibir el crecimiento de diferentes tumores murinos que generan RC y restringieron el crecimiento de metástasis establecidas producidas por tumores que no generan RC pero son sensibles a la RC generada por otros tumores. A su vez, y tan significativo como lo anterior, estos efectos antitumorales se lograron sin ningún efecto colateral indeseado Una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares asociados con el efecto antitumoral de estos isómeros de tirosina podría, eventualmente, ayudar a desarrollar métodos nuevos y menos tóxicos para combatir las enfermedades malignas; en particular para limitar el crecimiento acelerado de las metástasis después de la extirpación quirúrgica del tumor primario o después del padecimiento de traumas o estresores que pudieran ­despertar­ metástasis de su estado de ­tumor dormido­.

Concomitant tumor resistance (CR) is a phenomenon in which a tumor-bearing host is resistant to the growth of secondary tumor implants. This phenomenon has been described in human and animal systems and it can be generated by both immunogenic and non-immunogenic tumors. The relevance of CR to the mechanisms of metastases control has been highlighted by numerous observations showing that the removal of human and murine tumors may be followed by an abrupt increase in metastatic growth, suggesting that, upon certain circumstances, a primary tumor exerts a controlling action on its metastases which could be considered as secondary tumor implants developed spontaneously during the primary tumor growth. In our laboratory we have studied the CR induced by many murine tumors widely different in origin, histologic type and immunogenicity. Our results support the idea that during the primary tumor growth, there exist two temporally separate events of CR: the first one was exhibited only by small (<500 mm3 ) immunogenic tumors, it was tumor-specific and mediated by classical T-dependent immunological mechanisms. The second event was induced by both im munogenic and nonimmunogenic large (≥ 2000 mm3 ) tumors; it was non-tumor specific, thymus independent and correlated with the presence of a serum factor of low molecular weight that inhibited the in vitro and in vivo proliferation of tumor cells. When this anti-tumor serum activity was absent ­ in our hands, the only two cases were associated with highly metastatic tumors ­ the second event of CR did not exist, suggesting a direct correlation between the anti-tumor serum activity, the second event of CR and the ability to restrain metastatic growth. Although the mechanism associated with the first event of CR has, as said above, been elucidated as T cell­dependent, the molecular nature of the antitumor serum factor(s), which is at the root of the most universal manifestation of CR (that is, the second event of CR), remained an enigma for many years. In a recently published paper, we identified that antitumor serum factor(s) as a mixture of meta-tyrosine and ortho-tyrosine, two isomers of tyrosine that are not present in normal proteins. Both meta- and ortho-tyrosine inhibited the growth of different murine models of cancer that generate CR and could also block established spontaneous metastases produced by other murine models that do not generate CR but are very sensitive to the CR induced by other tumors. In addition, and most importantly, these anti-tumor effects were achieved without any collateral damage to the organism. A more profound understanding of the molecular mechanisms associated with the anti-tumor effects mediated by meta- and ortho-tyrosine could contribute to develop new and more harmless means to manage malignant diseases, especially by limiting the development of metastases that arise after resection of primary tumors or after other stressors that may promote the escape of metastases from dormancy.

Meta-tyrosine: A powerful anti-metastatic factor with undetectable toxic-side effects

Concomitant tumor resistance (CR) is a phenomenon in which a tumor-bearing host is resistant to the growth of secondary tumor implants and metastasis. While former studies have indicated that T-cell dependent processes mediate CR in hosts bearing immunogenic small tumors, the most universal manifestation of CR induced by immunogenic and non-immunogenic large tumors had been associated with an antitumor serum factor that remained an enigma for many years. In a recent paper, we identified that elusive factor(s) as an equi-molar mixture of meta-tyrosine and ortho-tyrosine, two isomers of tyrosine that are not present in normal proteins and that proved to be responsible for 90% and 10%, respectively, of the total serum anti-tumor activity. In this work, we have extended our previous findings demonstrating that a periodic intravenous administration of meta-tyrosine induced a dramatic reduction of lung and hepatic metastases generated in mice bearing two different metastatic murine tumors and decreased the rate of death from 100% up to 25% in tumor-excised mice that already exhibited established metastases at the time of surgery. These anti-metastatic effects were achieved even at very low concentrations and without displaying any detectable toxic-side effects, suggesting that the use of meta-tyrosine may help to develop new and less harmful means of managing malignant diseases, especially those aimed to control the growth of metastases that is the most serious problem in cancer pathology.

La resistencia concomitante antitumoral (RC) es el fenómeno según el cual un individuo portador de tumor inhibe el crecimiento de implantes tumorales secundarios y metástasis. Si bien desde hace tiempo se sabe que la RC inducida por tumores inmunogénicos de pequeño tamaño es generada por mecanismos inmunológicos dependientes de células T, por otro lado, la manifestación más universal de la RC, generada tanto por tumores inmunogénicos como no-inmunogénicos de gran tamaño, había sido asociada con un (unos) factor sérico antitumoral cuya naturaleza permaneció elusiva por años. En un trabajo reciente, nuestro grupo de trabajo identificó este factor como la mezcla equi-molar de meta-tirosina y orto-tirosina, dos isómeros de tirosina que no están presentes en proteínas normales y que demostraron ser responsables del 90% y 10%, respectivamente, de la actividad antitumoral total del suero. En este trabajo, continuamos nuestras investigaciones demostrando que la administración periódica de meta-tirosina reducía drásticamente el número de metástasis pulmonares y hepáticas en ratones portadores de dos tumores murinos altamente metastásicos y disminuía dramáticamente la mortandad (de 100% a 25%) de ratones con metástasis ya establecidas al momento de la extirpación quirúrgica del tumor. Estos efectos anti-metastásicos se lograron aun con muy bajas concentraciones de meta-tirosina y sin efectos tóxicos perceptibles, lo que sugiere que su uso puede ayudar a diseñar nuevas y menos nocivas estrategias para el tratamiento del cáncer, especialmente aquellas destinadas a controlar el crecimiento metastásico, que es el problema más grave en la enfermedad oncológica.

Regulatory B cells present in lymph nodes draining a murine tumor

In cancer, B cells have been classically associated with antibody secretion, antigen presentation and T cell activation. However, a possible role for B lymphocytes in impairing antitumor response and collaborating with tumor growth has been brought into focus. Recent reports have described the capacity of B cells to negatively affect immune responses in autoimmune diseases. The highly immunogenic mouse tumor MCC loses its immunogenicity and induces systemic immune suppression and tolerance as it grows. We have previously demonstrated that MCC growth induces a distinct and progressive increase in B cell number and proportion in the tumor draining lymph nodes (TDLN), as well as a less prominent increase in T regulatory cells. The aim of this research was to study B cell characteristics and function in the lymph node draining MCC tumor and to analyze whether these cells may be playing a role in suppressing antitumor response and favoring tumor progression. Results indicate that B cells from TDLN expressed increased CD86 and MHCII co-stimulatory molecules indicating activated phenotype, as well as intracellular IL-10, FASL and Granzyme B, molecules with regulatory immunosuppressive properties. Additionally, B cells showed high inhibitory upon T cell proliferation ex vivo, and a mild capacity to secrete antibodies. Our conclusion is that even when evidence of B cell-mediated activity of the immune response is present, B cells from TDLN exhibit regulatory phenotype and inhibitory activity, probably contributing to the state of immunological tolerance characteristic of the advanced tumor condition.

Cáncer experimental e inflamación sistémica en un modelo murino / Systemic inflammation and experimental cancer in a murine model

La asociación entre cáncer e inflamación en un órgano o tejido se encuentra sólidamente establecida. En efecto, se sabe que en sitios de inflamación crónica, existe una mayor probabilidad de que se origine un tumor y que procesos inflamatorios locales pueden acelerar el crecimiento de tumores preexistentes en animales y seres humanos. Por otro lado, la relación entre cáncer e inflamación sistémica ha sido menos estudiada. En este trabajo, demostramos que el crecimiento de un fibrosarcoma de ratón (MC-C) fue acompañado por inflamación sistémica, evidenciada por neutrofilia y por un aumento de la concentración sérica de las citoquinas pro-inflamatorias interleuquina-1 beta (IL-1 beta), interleuquina-6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-alfa) y de las proteínas de fase aguda C reactiva (CRP) y A amieloide (SAA). Hubo un pico de estas moléculas poco después de la inoculación del tumor, que cayó a valores normales después de la primera semana, para luego comenzar a incrementarse progresivamente en función del tamaño tumoral. Una variación similar fue vista en el porcentaje de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) circulantes. En ratones portadores de tumores grandes la mayoría de los PMN exhibían activación evidenciada por aumento en la generación de especies reactivas del oxígeno y alta expresión de los marcadores Gr1+/Mac1+. La inoculación de tioglicolato, que produce una inflamación sistémica transitoria, aceleró el crecimiento de MC-C, mientras que el tratamiento anti-inflamatorio con indometacina revirtió ese efecto. Esto sugiere que MC-C podría utilizar el fenómeno de inflamación sistémica que genera por sí mismo, como parte de su estrategia de crecimiento.

The link between cancer and inflammation in an organ or tissue has firmly been established on the basis that cancer tends to occur at sites of chronic inflammation and that local inflammatory processes can accelerate the growth of preexisting tumors in both animals and human beings. In contrast, the relationship between cancer and systemic inflammation has been less studied. In this work, we demonstrated that the growth of the murine fibrosarcoma MC-C, was accompanied by manifestations of systemic inflammation, as demonstrated by an increase in both the number of circulating polymorphonuclear neutrophils (PMN) and the serum concentration of the proinflammatory cytokines interleukin-1 beta (IL-1 beta), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and the acute phase proteins C reactive (CRP) and serum A amyloid (SAA). Two temporally separate peaks of systemic inflammation were detected during tumor development. The first was displayed during the first week after tumor inoculation. The second peak began around day 14 and its intensity was proportional to tumor size. In mice bearing a large MC-C tumor, a high number of circulating PMN and myeloid precursors were evident. Most of these cells exhibited activation evidenced by an increased reactive oxygen species generation and high expression of the Gr1+/Mac1+ markers. Inoculation of thioglycolate -which generates a transient systemic inflammation- accelerated the growth of MC-C tumor and reciprocally, inhibition of such systemic inflammation by using indomethacin, prevented that enhancing effect. This suggests that the systemic inflammation that the tumor generates on its own, could be part of its growth strategy.

Reversión del eclipse inmunológico y vacunación terapéutica contra el cáncer en un modelo experimental / Reversion of the immunological eclipse and therapeutic vaccination against cancer in an experimental model

Aunque existen vacunas para prevenir la aparición de tumores en animales de experimentación, la mayoría de los intentos por aplicar aquellas vacunas con fines terapéuticos contra tumores establecidos no han sido exitosos. Para comprender la naturaleza de esta refractariedad, estudiamos un tumor de ratón fuertemente inmunogénico inducido por el carcinógeno químico metilcolantreno. En nuestro modelo, el inicio de esta refractariedad coincidió con el comienzo de un estado de inmunosupresión conocido como "eclipse inmunológico" caracterizado por una pérdida o bloqueo de la respuesta inmune antitumoral después que el tumor ha superado cierto tamaño crítico. Este eclipse inmunológico fue acompañado por un proceso de inflamación sistémica en el organismo. El tratamiento de los ratones portadores de tumor con una única dosis del corticoide sintético dexametasona (DX) redujo los parámetros de inflamación sistémica e indujo la reversión del eclipse. Esta reversión no fue por sí misma curativa pero permitió que un tratamiento inmunológico basado en células dendríticas estimuladas con antígenos tumorales, que por sí solo era absolutamente ineficaz, pudiera ejercer un significativo efecto inhibidor sobre un tumor en crecimiento. El esquema de dos pasos que comprende, primero, un tratamiento antiinflamatorio para revertir el eclipse y segundo, una estrategia de vacunación basada en células dendríticas destinada a estimular la respuesta inmune antitumoral, podría servir, eventualmente, como un modelo de inmunoterapia contra tumores en animales y seres humanos.

Although animals can be prophylactically immunized against the growth of tumor implants, most of the attempts to use immunotherapy to cause the regression of animal and human tumors once they become established have been unsuccessful. To understand the nature of this refractoriness we have studied a methylcholanthrene-induced and strongly immunogenic murine fibrosarcoma. In our model, the onset of this refractoriness was associated with the beginning of an immunosuppressive state known as "immunological eclipse" characterized by a loss of the antitumor immune response when tumor grows beyond a critical size. This immunological eclipse was accompanied by the emergence of a systemic inflammatory condition. Treatment of tumor-bearing mice with a single dose of a synthetic corticosteroid, dexamethasone (DX), reduced significantly all parameters of systemic inflammation and simultaneously reversed the immunological eclipse. The reversion of the eclipse upon DX treatment was not curative itself, but allowed an immunological therapy based in dendritic cells pulsed with tumor antigens, which was itself absolutely ineffective, to exert a significant inhibitory effect against an established growing tumor. The two-step schedule using an anti-inflammatory treatment to reverse the immunological eclipse plus a dendritic cell-based vaccination strategy aimed to stimulate the anti-tumor immune response, could serve eventually as a model of immunotherapy against animal and human tumors.

ß-Lapachona: una naftoquinona con actividad antitumoral in vivo / ß-Lapachone: a naphthoquinone with antitumor activity in vivo

ß-Lapachona prolonga la sobrevida de ratones con leucemia inducida por el virus de Friend y de pollos con sarcoma inducido por el virus de Rous y recientemente ha demostrado inhibir la proliferación in vitro de varias líneas tumorales humanas. La estructura química de esta droga y presumiblemente su modo de acción, son muy diferentes de la estructura y modo de acción de las drogas antitumorales comúnmente utilizadas en la terapia. Por tal motivo, y con el propósito de ampliar el conocimiento sobre nuevas drogas antineoplásicas intentamos determinar, en este trabajo, si ß-lapachona era capaz de inhibir in vivo el desarrollo de un tumor de ratón no inducido por virus que ha demostrado ser refractario al tratamiento con drogas antineoplásicas convencionales. Se mostró que la administración oral y diaria de ß-lapachona redujo la toma tumoral y prolongó la sobrevida en aquellos ratones donde el tumor LB había crecido. El mayor efecto se produjo cuando la droga fue administrada en la concentración de 125 mg/Kg/día simultáneamente con un inóculo tumoral de 10n ó 10 elevado a la 4, células LB. El efecto sobre un inóculo mayor (10 elevado a la 5, células) o sobre un tumor vascularizado y en activo crecimiento fue más tenue aunque igualmente perceptible. Estos resultados son, en principio, promisorios, pero más experimentos, con diferentes concentraciones de la droga y con diferentes modelos tumorales serán necesarios para determinar adecuadamente el valor terapéutico de ß-lapachona sobre tumores murinos.

The role of apoptosis in the inhibition of a secondary tumor by concomitant resistance in a mouse model of metastases

Resistance of tumor-bearing mice to a second tumor challenge, that is, concomitant resistance, was studied using the LB tumor model. In a secondary LB tumor implant inhibited by concomitant resistance an increase in the percentage of apoptotic cells and alterations in cell cycle distribution were observed. Similar alterations were observed in LB tumor cells incubated with serum from tumor-bearing mice. The data presented in this paper suggest that apoptosis is one of the mechanisms involved in tumor dormancy due to concomitant resistance.

Rol del tejido conectivo en la relacion tumor-huesped / Role of the connective tissue in the tumor-host relationship

El mesodermo es la hoja germinativa involucrada en la regulación de los fenómenos de diferenciación y organización temporo-espacial del embrión. El tejido conectivo expresa alguna de estas funciones durante los fenômenos de reparación y regeneración de tejidos u órganos. El desarrollo normal de estos procesos depende de la interrelación epitelio-mesénquima y de la formación de una cantidad adecuada de estroma y de un tipo de colágeno o proteoglicano. Nuestra hipótesis sugiere que el cáncer sería un proceso regenerativo que fracasa como consecuencia de la alteración del tejido conectivo. El objetivo del presente trabajo ha sido conocer si el tejido conjuntivo y la sustancia fundamental amorfa (SFA) son capaces de regular la proliferación y muert de células normales y tumorales, y de ser así, de discriminar entre los factores que puedan interferir. Los resultados de los experimentos in vivo, ex vivo e in vitro revelaron que: 1) la SFA ejerce un efecto citotóxico directo y selectivo sobre las células tumorales; 2) la SFA reduce la capacidad proliferativa de células normales y tumorales; 3) el efecto citotóxico y antiproliferativo de la SFA no depende de la respuesta inmune celular o humoral, pero sí de la integridad química de sus componentes, ya que su desnaturalización reduce su capacidad antitumoral; 4) las células tumorales modulan las funciones reguladoras de la SFA mediante enzimas endocelulares liberadas al producirse la muerte celular inducida por la acción citotóxica de la misma SFA. Estos resultados sugieren que las células tumorales que permanecem viables pueden proliferar activamente dado que sobre ellas no se ejerce más el efecto inhibidor de la SFA, al mismo tiempo que son estimuladas por las enzimas. En consecuencia existiría una función reguladora del tejido conectivo sobre la proliferación y viabilidad de células tumorales, actividad que parece residir en la constitución molecular de la SFA del tejido conectivo.

Resistencia concomitante antitumoral / Antitumor concomitant resistance

La resistência concomitante de ratones portadores de un tumor contra un implante secundario de ese mismo tumor, fue evaluada en ratones eutímicos y atímicos usando 17 tumores con diferentes grados de inmunogenicidad. Durante el desarrollo tumoral, se observaron dos picos, temporalmente separados, de resistência concomitante: el primer pico fue detectado sólo con tumores inmunogénicos pequeños (< 500 mm3); fue específico de tumor y mediado por mecanismos inmunológicos clásicos dependientes de células T. El segundo pico fue exhibido por tumores grandes (> 2000 mm3) independientemente de su inmunogenicidad; fue inespecífico de tumor, timo-independiente y correlacionó con la presencia de un factor (o factores) del suero (ni anticuerpos ni complemento) que inhibía in vitro la proliferación de las células tumorales. De los 17 tumor estudiados, 15 mostraron una resistência concomitante moderada o fuerte. Los dos tumores restantes, que mostraron una resistencia concomitante débil o indetectable y que exhibían correspondientemente una baja o nula actividad inhibitoria en el suero, eran los únicos que daban metástasis pulmonares. Esto sugirió una correlación entre resistencia concomitante, ausencia de metástasis y la existência de un factor inhibidor en el suero. Este factor fue caracterizado parcialmente, mostrándose resistente al calor (5-10' a l00 grados Celsius y a cambios de pH, estimándose su peso molecular entre 850 y 1200 D; fue recuperado en columnas de HPLC (cromatografía líquida de alta performance) en una sola fracción presentando máxima absorción a 215 y 266 nm. Además, estudios de análisis de aminoácidos y de resonancia magnética nuclear sugirieron la presencia de una molécula de tirosina y una o más moléculas de hidratos de carbono en su estructura.